Sadržaj
- Prednost: osjetljivost
- Prednost: Specifičnost
- Nedostatak: sklon lažnim ili subjektivnim rezultatima
- Nedostatak: Visoka cijena i tehnički zahtjev
Western blot, analitička tehnika koja se koristi za određivanje određenog proteina u datom uzorku, koristi sposobnost enzima ili primarnog antitijela obilježenog fluorescencijom da se veže za svoj specifični antigen. To je proces u tri koraka koji započinje gel elektroforezom, a zatim slijedi blotina membrane i sondiranje s antitijelima. Otkrivanje proteina može biti izravno ili neizravno, pri čemu se potonji koriste obilježenim sekundarnim antitijelom usmjerenim protiv primarnog. Iako prihvaćen kao rutinska tehnika analize proteina, Western blot ima ograničenja i prednosti.
Prednost: osjetljivost
Jedan od najvećih argumenata u korist Western blota je njegova osjetljivost. Zbog svoje sposobnosti otkrivanja svega 0,1 nanograma proteina u uzorku, tehnika može teoretski poslužiti kao učinkovito sredstvo rane dijagnostike, osjetivši čak i najmanji imunogen odgovor virusa ili bakterija u uzorku pacijenta. Neizravna zapadna mrlja dalje se temelji na ovoj osjetljivosti na sposobnosti sekundarnog antitijela da pojača intenzitet signala koji detektira sustav za snimanje. Veća osjetljivost znači da je za ispitivanje potrebno manje antitijela, što značajno smanjuje troškove laboratorija.
Prednost: Specifičnost
Tehnika Western blot duguje svoju specifičnost dva velika faktora koja doprinose. Prvo, gel elektroforeza razvrstava uzorak u proteinima različitih veličina, naboja i konformacija. Ovaj postupak je sam po sebi ogroman korak prema otkrivanju, budući da trake formirane u gelu već daju naznake o veličini proteina ili polipeptida koji nas zanimaju. Specifičnost interakcije antitijelo-antigen služi kao drugi veliki faktor. Budući da specifična antitijela pokazuju afinitet za specifične proteine, postupak može selektivno detektirati ciljni protein čak i u smjesi od 300 000 različitih proteina.
Nedostatak: sklon lažnim ili subjektivnim rezultatima
Unatoč svojoj osjetljivosti i specifičnosti, Western blot još uvijek može dati pogrešne rezultate. Lažno pozitivni rezultati kada antitijelo reagira s nenamjenskim proteinima, što se često događa kada pacijent koji se testira na HIV ima tuberkulozu ili brojne parazitske infekcije. Lažno negativan, s druge strane, lako može rezultirati ako se većim proteinima ne pruži dovoljno vremena za pravilan prijenos u membranu. Nepravilno ispiranje i obrada često proizvode iskrivljene, izblijedjele ili čak višestruke pojaseve, zbog čega rezultati ispitivanja podliježu interpretaciji tehničara.
Nedostatak: Visoka cijena i tehnički zahtjev
Trošak Western blota sastavljen je od velikih pojedinačnih izdataka za obilježena antitijela, vješt analitičare i laboratorijsku opremu. Delikatna procedura, zapadnjača mrlja zahtijeva preciznost u svakom koraku da bi se pravilno identificirala sastojke uzorka. Mala pogreška u koncentraciji reagensa ili u razdoblju inkubacije može biti pogubna za cijeli postupak. Konačno, oprema potrebna za otkrivanje i snimanje - hemiluminescentni, fluorescentni, radioaktivni ili laserski detekcijski sustavi - može biti preskupa za prosječnu mikrobiološku jedinicu.