Sadržaj
- Enzimi i mjesta ograničenja
- Prava orijentacija
- Ligiranje ljepljivih završetaka zahtijeva manje DNK
- Različiti enzimi mogu dati isti ljepljivi kraj
Molekularno kloniranje uobičajena je biotehnološka metoda s kojom bi svaki student i istraživač trebao biti upoznat. Molekularno kloniranje pomoću vrste enzima koji se naziva restrikcijski enzim za rezanje ljudske DNK na fragmente koji se mogu umetnuti u plazmidnu DNA bakterijske stanice. Restriktivni enzimi prepolovili su dvolančane DNK na pola. Ovisno o restrikcijskom enzimu, rez može rezultirati ljepljivim ili tupim krajem. Ljepljivi krajevi korisniji su u molekularnom kloniranju jer osiguravaju da se fragment ljudske DNK umetne u plazmid u pravom smjeru. Proces ligacije ili spajanje fragmenata DNK zahtijeva manje DNK kada DNK ima ljepljive krajeve. I na kraju, višestruki ljepljivi krajnji enzimi mogu proizvesti isti ljepljivi kraj, iako svaki enzim prepoznaje različitu restrikcijsku sekvencu. To povećava vjerojatnost da će vaše DNK regiju koja vas zanima može izdvojiti ljepljivim krajnjim enzimima.
Enzimi i mjesta ograničenja
Restriktivni enzimi su enzimi koji rezavaju prepoznaju specifične sekvence na dvolančanoj DNK i režu DNK na pola u tom nizu. Prepoznati slijed naziva se mjesto restrikcije. Restriktivni enzimi nazivaju se endonukleaze, jer oni režu dvolančane DNK, tako normalno funkcionira DNK, na mjestima koja su između krajeva DNK. Postoji više od 90 različitih restrikcijskih enzima. Svako prepoznaje različita mjesta ograničenja. Restriktivni enzimi cijepaju njihova mjesta restrikcije 5.000 puta učinkovitije od ostalih mjesta koja ne prepoznaju.
Prava orijentacija
Restriktivni enzimi dolaze u dvije opće klase. Ili režu DNK na ljepljive krajeve ili tupim krajevima. Ljepljivi kraj ima kratko područje nukleotida, građevnih blokova DNK, koji nije povezan. Ova nesparena regija naziva se nadstrešnica. Kaže se da je prevjes ljepljiv jer želi i udružit će se s drugim ljepljivim krajem koji ima komplementarni niz prekrivanja. Ljepljivi krajevi su poput davno izgubljenih blizanaca koji se žele čvrsto zagrliti kad se sretnu. S druge strane, tupi krajevi nisu ljepljivi jer su svi nukleotidi već upareni između dva lanca DNK. Prednost ljepljivih krajeva je da se fragment ljudske DNK može uklopiti samo u bakterijski plazmid u jednom smjeru. Suprotno tome, ako i humana DNK i bakterijski plazmid imaju tupi krajevi, humana DNK se može umetnuti glave u rep ili od glave do glave u plazmid.
Ligiranje ljepljivih završetaka zahtijeva manje DNK
Iako se DNK s krajevima drže lakše pronalazeći se međusobno zbog svoje „ljepljivosti“, ni ljepljivi krajevi niti tupi krajevi ne mogu se stopiti u kontinuirani dio DNK. Za formiranje kontinuiranog komada DNA koji je u potpunosti povezan zahtijeva enzim koji se zove ligaza. Ligaze spajaju okosnice nukleotida na ljepljivim ili tupim krajevima, što rezultira u kontinuiranom lancu nukleotida. Budući da se ljepljivi krajevi brže pronalaze zbog privlačenja jedan za drugog, proces vezanja zahtijeva manje ljudske DNK i manje plazmidne DNK. Tupi krajevi DNK i plazmidi rjeđe se mogu naći, pa stoga ligacija tupih krajeva zahtijeva da se više DNK stavi u epruvetu.
Različiti enzimi mogu dati isti ljepljivi kraj
Mjesta restrikcije nalaze se na cijelom genomu organizama, ali nisu ravnomjerno raspoređena. U plazmidima se može zamisliti da budu smješteni jedan pored drugog. Znanstvenici koji žele izrezati fragment ljudske DNA iz ljudskog genoma moraju pronaći mjesta ograničenja koja su ispred i iza regije ulomaka. Osim što osiguravaju umetanje fragmenta DNA u pravom smjeru, različiti ljepljivi krajnji enzimi mogu stvoriti isti ljepljivi kraj iako prepoznaju različite sekvence restrikcije. Na primjer, BamHI, BglII i Sau3A imaju različite sekvence prepoznavanja, ali proizvode isti ljepljivi kraj GATC-a. To povećava vjerojatnost da će postojati ljepljiva mjesta za ograničenje koja kraj vašeg ljudskog gena od interesa.