Sadržaj
- Elektroforeza ima ograničenu analizu uzoraka
- Mjerenja elektroforeze nisu precizna
- Potreban je značajan početni uzorak
- Mogu se vizualizirati samo određene molekule
- Elektroforeza je mala propusnost
Gelna elektroforeza je tehnika u kojoj se biološke molekule odvajaju jedna od druge i identificiraju u biološkom istraživanju ili medicinskoj dijagnostici. Od svog razvoja 1970-ih, ove su tehnike bile neprocjenjive vrijednosti u identificiranju gena (DNK) i genskih proizvoda (RNA i proteina) od interesa za istraživanje. Posljednjih godina pojavile su se novije tehnike koje daju veću specifičnost i detalje o onome što se događa u živim sustavima. Iako ove tehnike nisu izbacile elektroforezu, a napredne manipulacije mogu proširiti održivost tehnike, važno je shvatiti što elektroforeza gela može, a što ne može učiniti.
Elektroforeza ima ograničenu analizu uzoraka
Elektroforeza je karakteristična za tkivo koje ste uzeli iz uzorka. Na primjer, ako na jagodicama obrišete južnu mrlju (vrstu elektroforeze), gledate gene iz epitelnih stanica vašeg obraza i nigdje drugdje u tijelu. To ponekad može biti korisno, ali istraživači su često zainteresirani za šire raširene učinke.
Tehnike poput in situ hibridizacije (ISH) mogu uzeti dio tkiva i analizirati ekspresiju gena na svakom malom području tog uzorka.Dakle, istraživači mogu pregledati svako područje mozga u uzorku s ISH-om, dok tehnike elektroforeze mogu gledati samo nekoliko područja odjednom.
Mjerenja elektroforeze nisu precizna
Gel elektroforeza može učinkovito odvojiti slične proteine različite težine (ovo je tehnika koja se naziva Western blotting). Preciznije ih može razdvojiti tehnikom poznatom kao 2d elektroforeza; to je uobičajeno kod proteomike.
Nažalost, sva mjerenja učinjena ovom tehnikom u najboljem su slučaju polukvantibilna. Da bi se dobila precizna masa (težina) proteina, mora se koristiti spektroskopija mase nakon što se protein očisti elektroforezom. Nadalje, usporedba relativnih količina različitih molekula oslanja se na gustoću pojasa (tamnoću) različitih mrlja na gelu. Ova metoda ima određeni stupanj pogreške, a uzorci se obično izvode više puta kako bi se dobili čisti rezultati.
Potreban je značajan početni uzorak
Elektroforeza je tehnika izolacije i vizualne identifikacije različitih biomolekula. To se postiže tako da se kroz gel provede električna struja za odvajanje nabijenih molekula različite težine. Ako je molekula koju zanima nije dovoljno uobičajena, njezin će se sastav gotovo nevidljivo vidjeti i teško je mjeriti.
DNA i RNA mogu se donekle pojačati prije pokretanja elektroforeze, ali nije praktično to učiniti s proteinima. Zbog toga je potreban veliki uzorak tkiva za provođenje ovih ispitivanja. To može ograničiti korisnost tehnike, posebno u medicinskoj analizi. Gotovo je nemoguće pokrenuti elektroforezu na uzorcima iz jedne stanice; protočna citometrija i imunohistokemija češće se koriste za procjenu protein-stanične ekspresije. Tehnika zvana PCR izvrsna je za precizno mjerenje malenih količina RNA.
Mogu se vizualizirati samo određene molekule
Elektroforeza je izvrsna za razdvajanje i identificiranje biomolekula srednje veličine do velikih veličina. Međutim, mnoge su molekule koje istraživači žele pogledati manje; mali hormoni, neurotransmiteri i ioni se ne mogu mjeriti elektroforezom. To je iz dva razloga: oni ne reagiraju pravilno s pripravkom za elektroforezu (obično tehnikom koja se naziva SDS PAGE) i, čak i da jesu, premali su da bi se pravilno odvojili te bi isticali dno gela. Umjesto toga, te se molekule mjere tehnikama kao što su RIAAs (radio-imuno-ispitivanja) i ELISA-e (imuno-absorbcijski test povezan sa enzimima).
Elektroforeza je mala propusnost
Gel elektroforeza je obično niska propusnost, što znači da ne daje podatke posebno brzo. Kontrastna elektroforeza, u kojoj možete istovremeno gledati malu šačicu RNA molekula, s PCR (lančana reakcija polimeraze), koja može istovremeno ocijeniti tisuće uzoraka. Slično tome, protočna citometrija može mjeriti tisuće pojedinih stanica i vršiti složene korelacije, dok elektroforeza masovno promatra stanice i ne može ih tako dobro razlikovati. PCR i protočna citometrija predstavljaju masovno paralelne i serijske procese, i oba daleko nadmašuju mogućnosti elektroforeze za generiranje podataka o istraživanju.