Sadržaj
Bakterije se uzgajaju u Petrijevim posudama na krutom mediju poznatom kao bakterijski agar, gdje se uzgajaju kružne kolonije. Za razliku od pojedinačne bakterijske stanice, kolonija je skupina bakterija dovoljno velika da bude vidljiva golim okom. Rast bakterija može se mjeriti jednostavnim promatranjem koliko kolonija je prisutno; međutim, kvantitativnije metode uključuju upotrebu prebrojavajuće komore ili, češće, održivih brojanja ploča. Potonji se koristi najčešće jer također daje kvalitativne informacije poput učinka različitih uvjeta rasta. Budući da u petrijevoj posudi može biti milijarda bakterija, za mjerenje je prvo potrebno razrjeđivanje uzorka tako da je moguće prebrojati broj kolonija.
U epruvetu dodajte 10 mikrolitara početne bakterijske kulture u 90 mikrolitara medija za razrjeđivanje. Čvrsto zatvorite poklopac epruvete i vrtložite kako biste dobili homogenu smjesu. Sada je uzorak jedna desetina njegove prvotne koncentracije.
Prenesite 10 mikrolitara ovog novog uzorka u novu epruvetu koja sadrži 90 mikrolitara medija za razrjeđivanje, pomiješajte ga ponovo. Još jednom, rezultat će biti daljnji razrijeđeni uzorak - sada će to biti jedna stotina njegove prvotne koncentracije. Ponovite ovo nekoliko puta, sve dok originalni uzorak nije razrijeđen između 104 i 1010 puta. Osigurajte da je svaka cijev označena pravilnim razrjeđivanjem, na primjer 10-1, 10-2 i tako dalje.
Na ploču sa agarima nanesite 10 mikrolitara posljednjeg razrjeđenja. Pomoću ruba za širenje distribuirajte bakterijsku otopinu po cijeloj površini ploče sa agarima. Ponovite ovo za još dvije ploče. Također je uobičajeno izvesti ove korake s drugim razinama razrjeđivanja za usporedbu. Obavezno označite dno tanjura. Zamijenite poklopce na svakoj ploči i ostavite da se agar ploče nekoliko minuta suše bilo na laboratorijskoj klupi ispod plamena ili u inkubatoru. Stavite ploče u inkubator koji treba postaviti na odgovarajuću temperaturu za soj bakterija. Ostavite da raste 12 do 16 sati.
Kolonije bi trebale biti vidljive nakon 16 sati; Međutim, neke genetske modifikacije mogu zahtijevati i dulje (na primjer, razvoj boje). Kad su kolonije uočljive, izvadite ploče i pronađite one koje imaju između 30 i 300 kolonija. Pomoću trajnog markera stavite točku na dno Petrijeve posude - stranu sa agarom, a ne poklopac - gdje god je kolonija vidljiva kroz agar. Prebrojite svaku točku markera. Ponovite za svako jelo.
Za mjerenje količine bakterija u polaznoj kulturi za ovaj eksperiment, razrjeđivanje je potrebno obrnuti u proračunima, i to na dva mjesta. Prvo, kad ste iz epruvete uzeli jedan mikroliter u posudu s Petrijem, uzeli ste jednu desetinu razrijeđenog uzorka, tako da morate pomnožiti sve sa 10 da biste to preokrenuli. Pored toga, ako je faktor razrjeđenja u epruveti bio, na primjer, 10-7 , tada se broj kolonija mora pomnožiti s 107 da bi se poništio učinak razrjeđivanja. Jednostavno uklonite negativni znak s eksponenta u proračunima. Koristite formulu:
× 10 × = Broj jedinica koje formiraju koloniju (CFU) po mililitru polazne kulture. Ovo je rast bakterija u vašim petrijevim posudama.