Sadržaj
Mrlja po Gramu je različita procedura bojenja koja pokazuje koje su bakterije gram-pozitivne ili gram-negativne na temelju njihove boje mrlje. Aceton alkohol jedan je reagens koji se koristi u ovom procesu za postizanje diferencijacije boja. Gram-pozitivne bakterije imaju gusti peptidoglikanski sloj i oboje ljubičasto, dok gram-negativni mikroorganizmi imaju malo premalo peptidoglikana i oboje ružičasto.
Primarna mrlja-kristalna ljubičica
Nakon što je pripremljen slajd uzorka bakterija, kristalna ljubičica se koristi za prvo unošenje uzorka. U ovom će trenutku i gram-pozitivne i gram-negativne bakterije postati ljubičaste. Obično se kristalna ljubičica nanosi na dijapozitiv 30 sekundi prije nego što isperete suvišnu mrlju vodom. Kristalna ljubičica može se prianjati malo na slojeve peptidoglikana, tako da se sva primarna mrlja neće isprati vodom.
Sarkastičan-Jod
Potom se jod dodaje uzorak jednu minutu. Djeluje kao mordant, koji služi za učvršćivanje boja u procesu bojenja. Jod obavlja ovu funkciju vezanjem na kristalnu ljubičicu i stvarajući netopljivi kompleks koji se puno bolje prianja za gusti sloj peptidoglikana koji se nalazi u gram-pozitivnim bakterijskim stanicama nego samo kristalno ljubičasta. Ne postoji korak pranja vodom nakon dodavanja joda.
Decolorizer-alkohol
Kao sredstvo za uklanjanje boje može se koristiti aceton ili etil alkohol. Alkohol rastvara lipide koji se nalaze u vanjskoj staničnoj membrani gram-negativnih bakterija, omogućujući kristalno ljubičasto-jodnom kompleksu da iscuri iz tanjih peptidoglikanskih slojeva. Alkohol se dodaje 10 do 20 sekundi; sipa se na tobogan sve dok se sav jod ne ispere i otjecanje ne postane bezbojno. U ovom trenutku u procesu bojenja po Gramu, gram-negativne bakterije su bezbojne, dok gram-pozitivne bakterije i dalje zadržavaju kristalno ljubičastu boju. Nakon što završite klizač, potrebno ga je isprati vodom kako bi se zaustavio učinak obezbojenja.
Suprotno obojenje-safranina
Zatim se dodaje safranin za povećanje vidljivosti i kontrast bezbojnim gram-negativnim bakterijama. Mrlja čini da ove bakterije izgledaju ružičasto pod mikroskopom. Budući da se mrlja dodaje cijelom uzorku, također mrlje i gram-pozitivne bakterije, ali tamnija od kristalne ljubičice skriva svjetliju ružičastu boju safranina. Nakon što se uzorak klizava poplavi safraninom oko minute, voda se koristi za ispiranje suvišnih mrlja koje se nisu lijepile na bakterijskim stanicama.