Sadržaj
- Kako djeluju puferi
- Zahtjevi pufera
- Odabir prikladnog međuspremnika
- Kako promijeniti pH pufera
- Primjeri bioloških pufera
U stanicama i živim organizmima tečnost koja se nalazi oko i unutar stanica održava se na konstantnom pH. PH unutar ovog sustava često je presudan za biokemijske reakcije koje se odvijaju u organizmu. Za proučavanje bioloških procesa u laboratoriju, znanstvenici koriste pufere za održavanje ispravnog pH tijekom eksperimenta. Good i kolege su izvorno opisali mnoge biološke pufere 1966. i danas se koriste u laboratorijima.
Kako djeluju puferi
Pufer je jednostavno otopina koja sadrži slabu kiselinu i njenu konjugiranu bazu. Kada se kiselina doda u pufer, ona reagira s konjugiranom bazom stvarajući slabu kiselinu i teško utječe na pH otopine.
Zahtjevi pufera
Brojne karakteristike čine biološki pufer učinkovitim. Trebali bi biti topljivi u vodi, ali ne topivi ili minimalno topivi u organskim otapalima. Pufer ne bi trebao prolaziti kroz staničnu membranu, jer to može utjecati na ponašanje stanica. Puferi trebaju biti netoksični, ne bi trebali apsorbirati UV zračenje i trebali bi ostati inertni i stabilni tijekom eksperimentalnog postupka. Temperatura i ionski sastav ne bi trebali mijenjati pH ili kapacitet puferiranja.
Odabir prikladnog međuspremnika
Odabrani tampon treba imati pKa u rasponu optimalnom za ispitivani postupak. Pufer s višim pKa je prikladan ako postoji vjerojatnost porasta pH tijekom eksperimenta, i obrnuto ako se očekuje pad pH. Koncentracije pufera trebaju biti optimizirane, jer koncentracije veće od 25 mM mogu imati bolju sposobnost pufera, ali mogu inhibirati stanične aktivnosti poput enzima. Metoda također diktira koji međuspremnik koristiti; na primjer, u elektroforezi je prikladan pufer s niskom ionskom snagom kako bi se spriječilo zagrijavanje matriksa gela.
Kako promijeniti pH pufera
Kako se pH može mijenjati s promjenama temperature, znanstvenici bi trebali testirati pH pufera na temperaturi na kojoj će izvesti eksperiment. Tris je pufer posebno osjetljiv na promjenu pH vrijednosti s temperaturom. Svi pH metri trebaju biti kalibrirani na radnoj temperaturi. Aditivi također mogu promijeniti pH, čineći potrebno ponovno testiranje. Da bi se pH promijenio dodaje se kiselina, obično klorovodična kiselina, ili baza, obično natrijev ili kalijev hidroksid; to treba učiniti polako da se spriječi inaktivacija ili kemijske promjene u puferu.
Primjeri bioloških pufera
TE pufer, koji iznosi 10 mM Tris · HCl i 1 mM EDTA, prikladan je za brojne pH vrijednosti za skladištenje nukleinskih kiselina. Elektroforeza je uobičajena metoda za proučavanje proteina ili nukleinskih kiselina; ovaj postupak koristi brojne pufere, uključujući Tris-acetat-EDTA, Tris-glicin i Tris-borat-EDTA pufere. Ti puferi sprečavaju zagrijavanje gel matrice i mogu sadržavati aditive poput uree i SDS, ovisno o ispitivanju.