Sadržaj
- TL; DR (Predugo; nisam pročitao)
- Bufer i sol
- Sredstva za otapanje
- Kelatna sredstva i inhibitori
- Alkalna liza
Lyse je riječ koja dolazi s grčkog jezika i znači samo "razdvojiti se" ili "rasprsnuti se". Pojmovi se odnose na ono što se događa s ćelijama u puferu za lizu, rješenje koje ih otvara da izvuku njihov sadržaj. Znanstvenici koriste pufere za lizu kada ekstrahiraju DNK ili proteine iz stanica za analizu, posebno u slučaju bakterija. Vrsta pufera stanične lize varira ovisno o vrsti eksperimenta, iako su u nastavku slijede neki uobičajeni izbori.
TL; DR (Predugo; nisam pročitao)
Puferi za lizu pomažu pri razbijanju otvorenih ćelija, pa im se može pristupiti ili ukloniti njihov sadržaj. Neki primjeri uključuju soli, deterdžente, helatne agense i inhibitore i neke alkalne kemikalije.
Bufer i sol
Puferi stabiliziraju pH dok se stanice dijele. Tris-HCL predstavlja jednu od najčešćih kemikalija za puferiranje na pH 8. HEPES je još jedna uobičajena kemijska pufer u tim eksperimentima. Natrijeva kloridna sol također može podići ionsku snagu, ukupnu koncentraciju rastvora izvan stanica. Ova posljednja točka ima određenu važnost jer voda može difuzirati kroz stanične membrane od područja male koncentracije rastvora do područja visoke koncentracije rastvora.
Sredstva za otapanje
Deterdženti rastvaraju stanične membrane tako da sadržaj stanica može izaći. Imaju i amfipatsku molekularnu strukturu (tj. Molekule s jednim krajem, koji lako stupaju u interakciju s molekulama vode, dok drugi hidrofobni ili "strahuju od vode" ne završavaju). Oni mogu otopiti masti formirajući micele, male grozdove gdje hidrofobni repovi molekula deterdženta usmjeravaju prema unutra molekule masti. Uobičajeni deterdženti uključuju natrijev dodecil sulfat ili SDS, NP-40 i tritonX.
Kelatna sredstva i inhibitori
Puferi za lizu obično uključuju i helatne agense poput etilendiaminetetraoctene kiseline (EDTA) ili etilen glikol tetra octene kiseline (EGTA). Te se kemikalije vežu za ione metala s dva pozitivna naboja (npr. Magnezij i kalcij), čineći ih nedostupnim za ostale reakcije. Mnogim DNK (proteinima koji žvaču DNK) i proteazama (bjelančevinama koje režu druge bjelančevine) potrebni su magnezijevi ioni da bi djelovali, tako da im je oduzet ovaj ključni sastojak, EDTA i EGTA pomažu u smanjenju razine proteaze ili aktivnosti DNAza. Oni to, međutim, ne isključuju u potpunosti, a neke proteaze ne ovise o kofaktorima magnezija, pa puferi za lizu ponekad uključuju i kemikalije nazvane inhibitori proteaze, koji se vežu na proteaze i onemogućavaju im pravilno funkcioniranje.
Alkalna liza
Alkalna liza, vrlo uobičajena tehnika čišćenja plazmida od bakterija, uključuje tri rješenja. Prva sadrži glukozu, tris-HCL pufer, EDTA i RNAzu. Glukoza stvara visoku koncentraciju rastvora izvan bakterija, tako da oni postaju malo mršaviji, što ih olakšava liziranje. EDTA i tris-HCL funkcioniraju kao što je već opisano, dok će RNAza žvakati bilo koju RNK u stanici da bi je izbacila iz smjera. Druga otopina zapravo lizira stanice. Ovaj sadrži deterdžent za SDS i NaOH, koji povećava pH na 12 ili više, denaturirajući bjelančevine u stanici i uzrokujući odvajanje DNK u pojedinačne niti. Treća otopina sadrži kalijev acetat za vraćanje pH na neutralniju razinu kako bi se lanci plazmidne DNK ponovno mogli sjediniti. U međuvremenu se denaturirani proteini skupljaju i talože, dok dodecil-sulfatni ioni zajedno s kalijevim ionima stvaraju netopljivi spoj koji se također taloži iz otopine.