Sadržaj
- Genomika i sekvencija DNK
- Definicija sekvence DNA
- Sekvenciranje DNK: rana istraživanja
- Sangerova najveća ambicija bila je sekvencioniranje velikih, cijelih genoma, ali sekvencioniranje minucioznih parova bakteriofaga blijedilo je u usporedbi s sekvenciranjem 3 milijarde baznih parova ljudskog genoma. Unatoč tome, učenje kako sekvencirati čitav genom nisko bakteriofaga bio je glavni korak ka spajanju čitavog genoma ljudskih bića. Budući da se DNK i kromosomi sastoje od milijuna baznih parova, većina metoda sekvenciranja odvaja DNK u male niti, i tada se DNA segmenti sastavljaju zajedno; Potrebno je samo vrijeme ili brzi, sofisticirani strojevi.
- Osnove DNK sekvenciranja
- Metode sekvenciranja DNK: Sanger metode
- Drugi uzbudljivi razvoj bila je metoda sačmarica koja je odjednom slučajno uzorkovala i sekvencirala do 700 parova baza. Sanger je također poznat po upotrebi dideoksi (dideoxynucleotide) metode koja ubacuje nukleotid koji završava lancem tijekom sinteze DNA kako bi označili dijelove DNA radi analize. Videoxynukleotidi remete aktivnost DNA polimeraze i sprečavaju izgradnju nukleotida na nizu DNK.
- Koraci sekvenciranja DNA
- Napredak tehnologije odvajanja DNA
- Projekt Ljudski genom
- Ostali primjeri DNK sekvenciranja
- Etičke implikacije sekvenciranja DNA
Nukleotidi su kemijski građevni blokovi života i nalaze se u DNK živih organizama. Svaki nukleotid sastoji se od šećer, fosfat i a baza koja sadrži dušik: adenin (A), timin (T), citozin (C) i gvanin (G). Specifični redoslijed ovih nukleotidnih baza određuje koje će proteine, enzime i molekule ćelija sintetizirati.
Određivanje redoslijeda ili redoslijeda nukleotida važno je za proučavanje mutacija, evolucije, napredovanja bolesti, genetskog ispitivanja, forenzičkih ispitivanja i medicine.
Genomika i sekvencija DNK
genomika je proučavanje DNA, gena, interakcija gena i utjecaja okoliša na gene. Tajna otkrivanja složenih unutarnjih djelovanja gena je u mogućnosti identificirati njihovu strukturu i položaj na kromosomima.
Plava boja živih organizama određena je redoslijedom (ili redoslijedom) parova baza nukleinskih kiselina u DNK. Kad se DNK replicira, adenin se pari s timinom, a citozin s gvaninom; smatraju se neusklađeni parovi mutacije.
Otkako je molekula dvostruke helikske deoksiribonukleinske kiseline (DNK) konceptualizirana 1953., napravljena su dramatična poboljšanja u području genomike i sekvence velikih razmjera DNK. Znanstvenici marljivo rade na tome da primijene ovo novo znanje na individualiziranom liječenju bolesti.
U isto vrijeme, tekuće rasprave omogućavaju istraživačima da ostanu ispred etičkih implikacija tako brzo eksplodirajućih tehnologija.
Definicija sekvence DNA
Sekvenciranje DNK postupak je otkrivanja slijeda različitih nukleotidnih baza u isječcima DNK. Segmentiranje cijelog gena omogućava usporedbu kromosoma i genoma prisutnih kod iste i različitih vrsta.
Mapiranje kromosoma korisno je za znanstvena istraživanja. Analizirajući mehanizme i strukturu gena, alela i kromosomskih mutacija u molekulama DNA sugerira nove načine liječenja genetskih poremećaja i zaustavljanje rasta karcinoma tumora.
Sekvenciranje DNK: rana istraživanja
Frederick Sanger metode određivanja DNK uvelike napredovala polje genomike počevši od 1970-ih. Sanger se osjećao spremnim riješiti sekvence DNA nakon što je uspješno sekvencirao RNA tijekom proučavanja inzulina. Sanger nije prvi znanstvenik koji se bavio sekvenciranjem DNK. Međutim, njegove pametne metode slijedanja DNK - razvijene u tandemu s kolegama Bergom i Gilbertom - dobile su Nobelovu nagradu 1980. godine.
Sangerova najveća ambicija bila je sekvencioniranje velikih, cijelih genoma, ali sekvencioniranje minucioznih parova bakteriofaga blijedilo je u usporedbi s sekvenciranjem 3 milijarde baznih parova ljudskog genoma. Unatoč tome, učenje kako sekvencirati čitav genom nisko bakteriofaga bio je glavni korak ka spajanju čitavog genoma ljudskih bića. Budući da se DNK i kromosomi sastoje od milijuna baznih parova, većina metoda sekvenciranja odvaja DNK u male niti, i tada se DNA segmenti sastavljaju zajedno; Potrebno je samo vrijeme ili brzi, sofisticirani strojevi.
Osnove DNK sekvenciranja
Sanger je znao potencijalnu vrijednost svog rada i često je surađivao s drugim znanstvenicima koji su dijelili njegova interesovanja za DNK, molekularnu biologiju i životnu znanost.
Iako su spore i skupe u usporedbi s današnjim tehnologijama sekvenciranja, Sangerove DNK metode praćenja u to su vrijeme hvale. Nakon pokušaja i pogreške, Sanger je pronašao tajni biokemijski "recept" za odvajanje niti DNA, stvaranje više DNK i utvrđivanje redoslijeda nukleotida u genomu.
Visokokvalitetni materijali lako se mogu kupiti u laboratorijskim studijama:
Metode sekvenciranja DNK: Sanger metode
Sanger je smislio kako izrezati DNA na male segmente pomoću enzima DNK polimeraza.
Potom je napravio više DNK-a od šablona i umetnuo radioaktivne tragače u novu DNA kako bi razmijenio dijelove odvojenih niti. Također je prepoznao da enzim treba temeljni premaz koji bi se mogao vezati za određeno mjesto na lancu predloška. Godine 1981. Sanger je ponovno napravio povijest pronalazeći genom 16.000 baznih parova mitohondrija.
Drugi uzbudljivi razvoj bila je metoda sačmarica koja je odjednom slučajno uzorkovala i sekvencirala do 700 parova baza. Sanger je također poznat po upotrebi dideoksi (dideoxynucleotide) metode koja ubacuje nukleotid koji završava lancem tijekom sinteze DNA kako bi označili dijelove DNA radi analize. Videoxynukleotidi remete aktivnost DNA polimeraze i sprečavaju izgradnju nukleotida na nizu DNK.
Koraci sekvenciranja DNA
Temperatura mora biti pažljivo podešena tijekom cijelog postupka odvajanja. Prvo se kemikalije dodaju u epruvetu i zagrijavaju kako bi se razvio (denaturirao) dvolančana molekula DNA. Tada se temperatura ohladi, što omogućuje temeljnom lijepljenju.
Zatim se temperatura podiže kako bi se potaknula optimalna aktivnost DNA polimeraze (enzima).
Polimeraza obično koristi dostupne normalne nukleotide koji se dodaju u većoj koncentraciji.Kad polimeraza dođe do nukleotida koji je povezan s bojom, polimeraza se zaustavlja i lančić završava na njoj, što objašnjava zašto se obojeni nukleotidi nazivaju "završetak lanca" ili "krajnici".
Proces se nastavlja mnogo, mnogo puta. Na kraju se nukleotid povezan sa bojom postavlja na svaki pojedinačni položaj DNK sekvence. Gel elektroforeza i računalni programi tada mogu identificirati boje boje na svakoj od DNK lanaca i utvrditi cijeli niz DNK na temelju boje, položaja boje i duljine niti.
Napredak tehnologije odvajanja DNA
Sekvence visoke propusnosti - općenito se naziva slijedeće generacije - koristi nova unapređenja i tehnologije za sekvencioniranje nukleotidnih baza brže i jeftinije nego ikad prije. Stroj za određivanje DNK lako može podnijeti velike dijelove DNK. U stvari, čitavi genomi mogu se napraviti za nekoliko sati, umjesto za godine, Sangerovim tehnikama sekvenciranja.
Metode sekvenciranja sljedeće generacije mogu se baviti DNK analizom velikog volumena bez dodatnog koraka amplifikacije ili kloniranja kako bi se dobilo dovoljno DNK za sekvenciranje. Strojevi za sekvenciranje DNK istodobno pokreću više reakcija sekvenciranja, što je jeftinije i brže.
U osnovi, nova tehnologija slijedanja DNA pokreće stotine Sangerovih reakcija na malom, lako čitljivom mikročipu koji se tada provodi kroz računalni program koji sastavlja niz.
Ova tehnika čita kraće fragmente DNK, ali je i dalje brža i učinkovitija od Sangerovih metoda slijeđenja, pa čak i veliki projekti mogu se brzo dovršiti.
Projekt Ljudski genom
Projekt ljudskog genoma, završena 2003. godine, jedna je od najpoznatijih studija sljedovanja do danas. Prema članku za 2018. godinu u Znanstvene vijesti, ljudski genom sastoji se od otprilike 46.831 gena, što je bio ogroman izazov nizu. Vrhunski znanstvenici iz cijelog svijeta proveli su gotovo 10 godina u suradnji i savjetovanju. Vodila Nacionalna istraživanja ljudskog genoma
Institut, projekt je uspješno mapirao ljudski genom pomoću kompozitnog uzorka uzetog od anonimnih davatelja krvi.
Projekt Ljudski genom oslanjao se na metode sekvenciranja bakterijskih umjetnih kromosoma (zasnovanih na BAC-u) za mapiranje baznih parova. Ova tehnika koristila je bakterije za kloniranje fragmenata DNA, što je rezultiralo velikim količinama DNK za sekvenciranje. Klonovi su tada smanjeni, stavljeni u stroj za sekvenciranje i sastavljeni u dijelove koji predstavljaju ljudsku DNK.
Ostali primjeri DNK sekvenciranja
Nova otkrića genomike uvelike mijenjaju pristupe prevenciji, otkrivanju i liječenju bolesti. Vlada je za istraživanje DNA izdvojila milijarde dolara. Za provođenje zakona oslanja se na DNK analizu. Kompleti za testiranje DNA mogu se kupiti za kućnu upotrebu kako bi se istražilo porijeklo i identificirale varijante gena koji mogu predstavljati rizik za zdravlje:
Etičke implikacije sekvenciranja DNA
Nove tehnologije često dolaze s mogućnošću socijalne koristi, ali i štete; primjeri uključuju neispravne nuklearne elektrane i nuklearno oružje za masovno uništenje. DNA tehnologije također dolaze s rizicima.
Emocionalna zabrinutost zbog DNK-a i alata za uređivanje gena poput CRISPR-a uključuje strahove da bi tehnologija mogla olakšati kloniranje ljudi ili dovesti do mutiranih transgenih životinja koje je stvorio lopov znanstvenik.
Češće etička pitanja koja se odnose na slijed DNK-a imaju veze s informiranim pristankom. Jednostavan pristup DNA testiranju izravno za kupca znači da potrošači možda neće u potpunosti razumjeti na koji će se način koristiti, pohranjivati i dijeliti njihove genetske informacije. Laici možda nisu emocionalno spremni učiti o njihovim neispravnim varijantama gena i zdravstvenim rizicima.
Treće strane, poput poslodavaca i osiguravajućih društava, mogu potencijalno diskriminirati pojedince koji nose oštećene gene koji mogu stvoriti ozbiljne medicinske probleme.