Sadržaj
Kod rada s tekućinskom kromatografijom visokih performansi (HPLC) dobra je kalibracija apsolutno nužna kako bi se osigurali pouzdani i kvalitetni rezultati. Pravilna kalibracija HPLC instrumenta započinje izradom odgovarajućeg standarda kalibracije. U većini slučajeva, umjeravanje zahtijeva niz standarda povećanja koncentracije kako bi se dobilo ono što je poznato kao kalibracijska krivulja. Ovo je crtana crta i pridružena jednadžba koja opisuje odnos koncentracije kemikalije na koju se ispituje i odgovora HPLC detektora.
Odredite kemikaliju koju želite testirati na HPLC ("analit"). Na primjer, možda želite testirati seriju bezalkoholnih pića na sadržaj fruktoze, u tom slučaju fruktoza bi bila analit.
Dobivanje količine kemikalije analita odgovarajuće čistoće. Čistoća obično treba biti veća od 99%, a analit treba biti kupljen od ugledne kompanije za opskrbu kemikalijama. U slučaju fruktoze, na primjer, kupili biste čistu fruktozu od dobavljača kemikalija, a ne iz trgovine.
Odredite maksimalne i minimalne očekivane koncentracije analita u uzorcima koje namjeravate testirati na HPLC. U slučaju bezalkoholnih pića, ispitali biste etikete pića i utvrdili najniži i najveći sadržaj fruktoze među pićima koja ćete testirati. Imajte na umu da se početni uzorak (bezalkoholno piće) može razrijediti ili na drugi način manipulirati tijekom pripreme za analizu (ovisno o HPLC metodi koja se koristi) i tako se koncentracija analita u uzorcima koji se stvarno ubrizgavaju u HPLC može mijenjati. Koncentracija analita u uzorcima koja se odvija na HPLC mora se uzeti u obzir.
Odredite otapalo u kojem ćete otopiti svoj analit da biste sastavili standarde kalibracije. Ovo otapalo mora biti u stanju pravilno otopiti analit u relativno širokom rasponu koncentracija (barem tako visokim kao u uzorcima koje namjeravate testirati). Takođe, ovo otapalo bi u idealnom slučaju trebalo da bude vrlo slično "pokretnoj fazi:" otapala koje se koristi za nošenje uzoraka kroz instrument HPLC.
Izračunajte količinu analita koja je potrebna da se napravi "osnovni standard" rješenje analita. To se utvrđuje množenjem potrebne koncentracije osnovnog standarda na željeni volumen. Koncentracija analita u ovoj otopini trebala bi biti barem 10% veća od najveće predviđene koncentracije uzorka. Ako je najveća očekivana koncentracija fruktoze u uzorku bezalkoholnih pića 8 grama / 100 mililitara, tada bi se osnovni standard mogao postići do koncentracije fruktoze od 10 grama / 100 mililitara. Razumna zapremina je 500 mililitara, pa bi bilo potrebno 8/100 mL x 500 mL = 40 grama fruktoze.
Odmjerite potrebnu količinu analita na odgovarajuću razinu preciznosti. Često je pogodna vrijednost težine u gramima precizno na jedno ili dva decimalna mjesta, ali za neke metode će možda trebati veća preciznost.
Odmjereni analit prenesite u volumetrijsku tikvicu potrebnog volumena i dodajte željeno otapalo u oznaku za punjenje. Upotreba volumetrijske tikvice (na primjer, od stupnjevane čaše, na primjer) povećava preciznost standardne vrijednosti koncentracije. Osigurajte da se sav analit prenese u tikvicu; koristite ga za otapanje, ako je potrebno.
Zaustavite volumetrijsku tikvicu i lagano protresite ili preokrenite dok se analit potpuno ne otopi.
Napravite seriju različitih razrjeđenja osnovnog standarda prijenosom poznatih količina osnovnog standarda u volumetrijske tikvice, koristeći pipete za precizan prijenos, dodajući otapalo. Najniža standardna koncentracija trebala bi biti ispod najnižeg predviđenog uzorka koji se analizira. U primjeru bezalkoholnih pića, ako je najmanja očekivana koncentracija fruktoze u uzorku 2 grama / 100 ml, tada se može napraviti standard od 1 gram / 100 ml. To bi se postiglo desetostrukim razrjeđivanjem zaliha. Standardna serija trebala bi sadržavati ukupno 5 ili 6 koncentracija, tako da bi bila potrebna dodatna razrjeđenja kako bi se dobili standardi od možda 3, 5 i 8 grama fruktoze / ml. Sada imate niz standardnih rješenja s kojima možete umjeriti HPLC.