Sadržaj
Količite vaš RNA uzorak mjerenjem njegove apsorpcije ultraljubičastog svjetla (UV). Nano kapljica spektrofotometra upotrijebit će samo jedan ili dva mikrolitara vašeg uzorka, koje možete povratiti. Ostali spektrofotometri zahtijevaju mnogo veći uzorak. Koeficijent izumiranja nukleotida na UV talasnoj duljini od 260 nm pri svjetlosnom putu od 1 cm iznosi 20. Temeljem ovog koeficijenta ekstinkcije apsorbancija 40 µg / ml RNA pod istim uvjetima je jedna. Pomoću ovih podataka možete izračunati koncentraciju svog RNA uzorka.
Po potrebi razrijedite uzorak. Standardno razrjeđenje mikrokuvice je 1:40. Napravite ovo razrjeđivanje dodavanjem 2 uL uzorka RNA u sterilnu vodu 78 ul.
Slijedite protokole vašeg određenog spektrofotometra da biste kalibrirali uređaj koristeći prazno, a zatim odredite optičku gustoću svog uzorka na UV valnoj dužini od 260 nm.
Pomnožite apsorpciju uzorka s faktorom razrjeđenja s 40 μg RNA / ml. Jednadžba bi bila: „Koncentracija RNA (µg / ml) = (OD260) x (faktor razrjeđenja) x (40 µg RNA / ml) / (1 jedinica OD260)“ (Hofstra.edu) Na primjer: Ako ste uzorak razrijedili sa 1:40, a očitavanje apsorbancije bilo je 0,08, pomnožili biste 0,08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0,13 µg / µL
Izračunajte čistoću svog uzorka uzimanjem drugog očitavanja apsorbancije na valnoj duljini od 280 nm. Omjer OD 260 / OD 280 ukazuje da li je - i na kojoj razini - vaš uzorak kontaminiran proteinom ili fenolom. Rezultat od 1,8 do 2,0 ukazuje na kvalitetnu RNA.