Sadržaj
- Razrjeđivanje uzoraka, posađivanje i inkubacija
- Ručno brojanje
- Automatizirano brojanje
- Čineći brojanje složenijim
Jedan od klasičnih načina za određivanje koncentracije mikroba u uzorku je razrjeđivanje uzorka, rast mikroba na pločama i brojanje kolonija. Nasađeni mikrobi rastu iz jedinice koja tvori koloniju koja se sastoji od jedne ili više stanica u vidljivu koloniju koja se može vidjeti i prebrojati. Bakterije su najčešći mikrobi za procjenu broja ploča. Broj kolonija koristi se za otkrivanje i brojanje mikroba u tlu, vodi i hrani. Protokoli za brojanje kolonija naglašavaju točan i metodički pristup.
Razrjeđivanje uzoraka, posađivanje i inkubacija
Ako jednostavno razmažete uzorak mikroba na ploči s agarima, vidjet ćete toliko jedinica koje tvore koloniju da bi se pojedine kolonije stapale, pa ih je nemoguće prebrojati. Da biste riješili taj problem, uzorak izmiješajte u tekući medij, uzmite malu količinu te smjese i razrijedite ga dalje. Ponovite ovaj postupak šest do 10 puta. Konačno razrjeđenje raširite na ploči s agarima i inkubirajte četiri do sedam dana prije nego što brojite kolonije.
Ručno brojanje
Primarni trik u brojanju kolonija je brojanje svake kolonije točka. Jedan od pristupa je postavljanje Petrijeve posude na pozadinu rešetke i brojanje kolonija u svakoj ćeliji rešetki, krećući se metodskim uzorkom kroz sve ćelije. Obilježavanje prebrojanih kolonija na stražnjoj strani Petrijeve posude također može biti koristan pristup. Općenito, trebat ćete brojati najmanje tri ploče; za robusne zaključke koristite samo ploče s 30 do 300 kolonija, sugerira Microbiology Network, tvrtka koja pruža usluge savjetovanja laboratorijima i proizvođačima. Ploče s kolonijama koje su prebrojne ili imaju premalo kolonija treba ponovno posijati novim razrjeđivanjem.
Automatizirano brojanje
Ljudska greška dodaje vremenu uključenom u ručno brojanje kolonija. Da biste poboljšali i točnost i učinkovitost, Petri zdjelu stavite u automatizirani uređaj za brojanje kolonija. Automatizirani brojači kolonija slikaju posudu, odvajaju kolonije od pozadine i zatim koriste algoritam za brojanje kolonija na tanjuru. Algoritmi mogu imati poteškoća u razlikovanju kolonija kada se dvije ili više kolonija dodiruju na rubovima, tako da je ovo područje u tijeku razvoj softvera.
Čineći brojanje složenijim
Točnost izračunavanja gustoće mikroba iz broja kolonija ima određena ograničenja. Jedinice koje tvore koloniju mogu biti jedna ćelija, lanac ćelija ili čitava skupina ćelija. Pretpostavka je da kolonija predstavlja jednu stanicu, pa koncentracije izračunate iz broja kolonija mogu biti niske. Različiti mikrobi trebaju različite uvjete rasta, a kolonije na ploči predstavljaju samo one mikrobe koji uspijevaju na tom mediju rasta u tim uvjetima inkubacije. Pored toga, brojanje kolonija ne registruje mrtve stanice, što je važno pitanje kada vam je potrebna koncentracija stanica u izvornom uzorku.