Sadržaj
Western bloting je jedan od najčešćih postupaka u biokemijskim laboratorijima. U osnovi se odvajaju proteini od uzorka po veličini, a zatim se testira pomoću antitijela da bi se utvrdilo postoji li dati protein. Korisna je ne samo u istraživanjima, već iu medicinskim ili dijagnostičkim laboratorijima; Na primjer, testovi i za HIV i za lajmsku bolest uključuju ispitivanje imunosorbentom povezanog enzimom (ELISA) test, a zatim Western blot ako je test ELISA pozitivan. Unatoč svojoj popularnosti, Western blotning ima nekoliko nedostataka.
Nonquantitative
Klasične zapadne mrlje su nekvalitetne. Drugim riječima, iako mogu reći istraživačima je li određeni protein prisutan, oni ne omogućavaju kvantificirati koliko je proteina prisutno. Neke biotehničke tvrtke sada prodaju setove koji istraživačima ili laboratorijskim tehničarima omogućuju da kvantificiraju količinu proteina prisutnom pomoću standardne krivulje - ali to djeluje samo ako su dostupni čisti uzorci istog proteina. Nadalje, molekulska masa proteina može se procijeniti samo Western blot-om, a ne precizno kao u masnoj spektrometriji.
antitijela
Western blot može se izvesti samo ako su dostupna primarna antitijela protiv proteina koji vas zanima. Iako su antitijela za mnogo različitih proteina dostupna od biotehničkih tvrtki, ona nisu jeftina; ako primarna antitijela nisu dostupna za određeni protein, neće biti moguće izvesti Western blot u potrazi za tim određenim proteinom. Nadalje, istraživači će možda željeti utvrditi je li protein na neki način modificiran - na primjer, ako je bio fosforiliran (ako je na njega bila priključena fosfatna skupina) - a tehnikom Western blot potrebna su antitijela specifična za modificirane protein.
Trening
Ako pravilno izvodite vestern ili kako biste dobili dobre rezultate, može biti izazovno pa osoblje mora biti dobro obučeno.I u ovome, kao iu mnogim drugim, iskustvo je možda najbolji učitelj; Međutim, čak i za iskusnog tehničara, zapadnjačka mrlja zahtijeva mnogo vremena. Primjerice, dio eksperimenta u gel elektroforezi obično traje od jednog do dva sata. Druge zadatke možete izvoditi dok se gel pokreće, naravno, ali eksperimentu je potrebno dosta vremena da dobijete rezultate.
Ostala ograničenja
Antitijela mogu ponekad pokazati neko izvan ciljano vezivanje, što može imati lošije rezultate. Osim toga, uz Western blot, koristite antitijelo protiv određenog proteina, pa će vam rezultati reći samo ako je taj protein prisutan. Masna spektrometrija visoke rezolucije, nasuprot tome, otkriva sve bjelančevine prisutne u uzorku, a za razliku od klasičnog Western blot-a, ona je kvantitativna. Važno je, naravno, imati na umu da je masena spektrometrija mnogo skuplja, a također i tehnički zahtjevnija za upotrebu u odnosu na Western blot.