Sadržaj
Lančana reakcija polimeraze ili PCR tehnika je koja fotokopira jedan fragment DNK u mnogo fragmenata - eksponencijalno mnogo. Prvi korak je u PCR-u zagrijavanje DNA tako da se denaturira, odnosno topi u pojedinačne niti. Struktura DNK je poput ljestvi od konopa u kojoj su rešetke užadi s magnetskim krajevima. Magneti se povezuju i tvore trake, nazvane para baze, i tako se odupiru da se razdvoje. Svaki se fragment DNA topi u pojedinačne niti na različitim temperaturama. Razumijevanje načina na koji se struktura DNK-a spaja pomoću pojedinih dijelova DNA dat će uvid zašto se različiti fragmenti DNA tope na različitim temperaturama i zašto su takve visoke temperature prije svega potrebne.
Topljenje! Topljenje!
Prvi korak PCR-a je otopiti DNK tako da se dvolančana DNK razdvaja na jednolančanu DNK. Za DNK sisavaca, ovaj prvi korak obično uključuje toplinu od oko 95 stupnjeva Celzijusa (oko 200 Fahrenheita). Pri ovoj temperaturi vodikove veze između parova baza A-T i G-C ili stuba u DNK ljestvi se raspadaju, otključavajući dvolančane DNK. Međutim, temperatura nije dovoljno vruća da slomi kralježnicu fosfata i šećera koja čini pojedine žice ili stupove ljestvi. Potpuno odvajanje pojedinačnih lanaca priprema ih za drugi korak PCR-a, koji se hladi kako bi se kratkim fragmentima DNA, nazvanim prajmerima, moglo vezati pojedine niti.
Magnetni patentni zatvarači
Jedan od razloga zašto se DNK zagrijava na visoku temperaturu od 95 stupnjeva Celzija jest taj što je dulji dvostruki lanac DNK, više želi ostati zajedno. Dužina DNK jedan je od faktora koji utječe na talište odabrano za PCR na tom komadu DNK. Parovi A-T i G-C u dvolančanoj DNK vezi međusobno drže dvočlanu strukturu zajedno. Što se više uzastopnih parova baza između dva jednostruka lanca veže, to se više i njihovih susjeda želi povezati, a jača privlačnost između dvaju niti. To je poput patentnog zatvarača napravljenog od malih magneta. Dok zatvaraš patentni zatvarač, magneti će, naravno, htjeti zatvarati i ostati zatvoren.
Jači magneti zalijepe se čvršće
Drugi faktor koji utječe na temperaturu topljenja koju treba odabrati za svoj fragment DNA je količina parova baza G-C prisutnih u tom fragmentu. Svaki par baza je poput dva mini-magneta koji privlače. Par izrađen od G i C mnogo je snažnije privlačan od para A i T. Tako će komad DNK koji ima više G-C parova od drugog fragmenta zahtijevati višu temperaturu prije topljenja u pojedinačne niti. DNA prirodno apsorbira ultraljubičasto svjetlo - tačno na valnu duljinu od 260 nanometara - a jednolančana DNK apsorbira više svjetla nego dvolančana DNK. Dakle, mjerenje količine apsorbirane svjetlosti način je za mjerenje koliko se vaša dvolančana DNK rastopila u pojedinačne niti. Učinak "magnetskih patentnih zatvarača" parova baza G-C i A-T uzrokuje da graf apsorpcije svjetlosti dvolančane DNA graficirane protiv povećanja temperature bude sigmoidan, oblikovan kao S, a ne ravna linija. Krivulja S predstavlja otpor timskog rada koji bazni parovi pružaju protiv vrućine jer se ne žele razdvajati.
Točka na pola puta
Temperatura na kojoj se dužina DNA topi u jednostruke niti naziva se njegovom temperaturom taljenja, koja je označena kraticom "Tm". To označava temperaturu na kojoj se polovica DNK-a u otopini otopila u pojedine niti, a druga polovica još u dvostrukom obliku. Temperatura taljenja različita je za svaki fragment DNA. DNK sisavaca ima sadržaj G-C od 40%, što znači da je preostalih 60% baznih parova As i Ts. Njegov 40-postotni sadržaj G-C uzrokuje da se DNK sisavaca topi na 87 stupnjeva Celzija (oko 189 Fahrenheita). Zbog toga je prvi korak PCR-a na DNK sisavaca njegovo zagrijavanje na 94 Celzijeva stupnja (201 Fahrenheit). Samo sedam stupnjeva toplije od temperature taljenja i svi dvostruki niti potpuno će se rastopiti u pojedinačne niti.