Sadržaj
Nakon što pokrenete DNK uzorke na agaroznom gelu i fotografirate ih, možete ih spremiti za kasnije, u kojem trenutku možete analizirati rezultate i interpretirati ih. Vrste stvari koje tražite ovisit će o prirodi vašeg eksperimenta. Ako, primjerice, radite DNK, morat ćete usporediti veličinu komada DNK iz dva uzorka - možda iz uzorka osumnjičenog i s mjesta zločina. Ako radite s plazmidima bakterija, nasuprot tome, možda ćete morati biti sigurni da plazmid sadrži umetak. Prema tome, način tumačenja gela ovisit će dijelom o eksperimentu koji ste izveli. Bez obzira na to, postoje neka opća pravila koja možete primijeniti.
Počevši od vrha slike, izmjerite udaljenost svakog pojedinog pojasa u "standardnoj" traci vašeg gela (aka ljestvice). Traka standarda sadrži dijelove DNK čija je veličina već poznata, tako da biste već trebali započeti eksperiment prije početka eksperimenta. Izmjerite i udaljenost koju su prelazili pojasevi u svim uzorcima traka.
Podijelite udaljenost svakog standarda i svake trake u uzorcima prijeđenim udaljenostom do dna gela. Rezultat se naziva relativna pokretljivost. Možete koristiti program za proračunske tablice da biste napravili aritmetiku za vas, ako će ovaj korak učiniti bržim.
Unesite relativnu mobilnost i veličinu svakog standarda u program za proračunske tablice, a zatim upotrijebite grafički alat za programe proračunskih tablica da biste stvorili graf tih podataka s relativnom mobilnošću na osi x i veličini na y.
Stavite liniju na graf koristeći nelinearnu regresiju. Ako trebate znati kako to učiniti, potražite odjeljak za pomoć programa za proračunske tablice. Završili biste s jednadžbom koja je možda slična sljedećem:
y = (0,3) x ^ -2,5
Imajte na umu da će x biti relativna pokretljivost, dok je y veličina. Također imajte na umu da vaša jednadžba može imati potpuno različite brojeve za eksponent i koeficijent - ova jednadžba je samo predstavljena kao hipotetski primjer.
Uzmite relativnu pokretljivost bendova iz svog uzorka i uključite je kao x kako biste izračunali veličinu DNK komada u uzorcima.
Pretpostavimo da je jednadžba dobivena programom za proračunske tablice doista bila y = (0,3) x ^ -2,5, a relativna pokretljivost određenog uzorka uzorka bila je 0,68. Zamjenom 0,68 u vašu jednadžbu pronalazite sljedeće:
y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5
Pomoću kalkulatora podižete 0,68 na -2,5 i pronalazite sljedeće:
y = (0,3) (2,62)
y = 0.786
koja bi tada bila procijenjena veličina DNK u kilobazama DNK u jednom od pojasa iz vašeg uzorka.
plazmidi
Imajte na umu da ćete možda trebati ili ne trebati koristiti upute u ovom odjeljku. Elektroforeza gela agaroze često se koristi kako bi se potvrdilo da plazmid sadrži zadani umetak. Ako ne radite s plazmidima, možete preskočiti ovaj odjeljak. Ako se ipak nalazite, slijedite ove upute.
Primijetite da ako radite s nerezanim ili narezanim plazmidima, ne možete procijeniti veličinu pomoću postupka iz gornjeg odjeljka 1. To je zato što neobrezani i ozlijeđeni plazmidi migriraju različitim brzinama od linearne DNK.
Usporedite broj pojaseva u svakom traku. Podsjetimo da restrikcijski enzim siječe DNK na mjestima na kojima se događa određena sekvenca koja se naziva mjesto restrikcije. Ako je uzorak tretiran s dva restrikcijska enzima, trebaju biti prisutni trak za umetak i traka za ostatak plazmida. To je zato što će uložak biti okružen s dva mjesta restrikcije, svako za različite enzime, tako da posjekotine na obje ove stranice oslobađaju umetak od plazmida. Rez na samo jednom mjestu pretvorit će plazmid u linearnu DNK. Uzorak rez s bez restriktivnih enzima ili jednim restrikcijskim enzimom trebao bi tada sadržavati jednu traku, dok uzorak rez s dva restrikcijska enzima treba sadržavati dva pojasa.
Pazite na pojaseve stvorene pomoću nadimka DNA plazmida. Narezani plazmid ima rez samo u jednom niti, tako da migrira sporije od presječenog plazmida. Izrezani plazmidi zauzvrat migriraju sporije od nerezane DNK.
Procijenite veličinu umetka koristeći postupak opisan u odjeljku 1 i utvrdite odgovara li vašim očekivanjima (koja će se razlikovati ovisno o eksperimentu.)