Sadržaj
Genetska plava stanica kodirana je unutar svog genetskog materijala, ili DNK. Kako DNK nikada ne napušta jezgro ćelije, kako bi ove informacije dospjele u citoplazmu u kojoj borave drugi proteini i biokemijske komponente, potrebno je najprije transkribirati DNK u messenger RNA (mRNA ili poly (A) RNA). Ta se mRNA tada pretvara u proteine koji obavljaju mnoge funkcije stanice. Da bi se otkrile ili kvantificirale vrlo rijetke mRNA, napravile sonde za mikroračune ili izgradile biblioteke komplementarnih molekula DNA, mRNA se mora izolirati. Međutim, ukupna ekstrakcija RNA (tj. Sva RNA u stanici) i naknadna izolacija mRNA nisu međusobno isključivi procesi; prvo se mora izvesti kako bi se mRNA mogla izdvojiti.
Izolacija mRNA iz ukupne RNA
TRIzol homogenizacija: Ukupna RNA uključuje svu mRNA, prijenosnu RNK, ribosomalnu RNK i ostale nekodirajuće RNA. Da biste ih odvojili od ostalih staničnih komponenti, stanica se prvo otvara i otpušta svoj sadržaj. To se postiže resuspendiranjem stanica peletiziranih centrifugiranjem (centrifugiranjem velikim brzinama) u TRIzol reagensu (Life Technologies). Ostale verzije TRIzola (poput Ambionovog TRI reagensa) djeluju slično.
Totalna izolacija RNA: Koristi se niz centrifuga radi odvajanja različitih komponenti (proteina, DNK, RNA) stanice u slojeve ili faze unutar suspenzije. Gornja faza žute boje sastavljena je od masti i može se odbaciti. Željena faza je obojena crveno, sadrži ukupnu RNA i zadržava se. Nakon provođenja ekstrakcije fenol-kloroforma i niza ispiranja alkoholom upotrebom izopropanola i etanola, RNA se može granulirati radi izolacije mRNA. Dodajte RNase inhibitore da spriječite ovaj enzim da razgradi ukupnu RNA.
Ekstrakcija mRNA: Uobičajena je upotreba kompleta za izoliranje mRNA, jer domaći laboratorijski protokoli ne stvaraju velike količine visoko pročišćenih mRNA. Komercijalni setovi uključuju Invitrogen-ov FastTrack 2.0 ili Ambijev Poly (A) čisti mRNA izolacijski komplet. Ovi su osnovni koraci zajednički takvim setovima:
a) Pomiješajte RNase-inhibirani pufer za lizu koji se nalazi u kompletu s do 300 mikrolitara ukupne RNA.
b) Zagrijte 5 minuta na 65 Celzijevih stupnjeva, a zatim odmah ohladite uzorak na ledu jednu minutu.
c) Pomiješajte to sa 0,5M natrijevim kloridom, a zatim potpuno otopite Oligo dT (oligodeoksitimidilnu kiselinu) u ovom uzorku.
d) Centrifugirajte ovaj uzorak i prikupite supernatant, koji se ispere nekoliko puta u nizu veziva i pufera sa malo soli dobivenih u setovima.
e) Eluirajte mRNA nekoliko puta dok se ne dobije volumen naveden u kompletu (npr. 500 mikrolitara).
f) Talog eluata precipitacijom natrij acetatom i etanolom. Ponovno suspendirajte u do 20 mikrolitara vode obrađene dietilpirokarbonatom (DEPC).
g) Čuvajte na -80 stupnjeva Celzija i provjerite kvalitetu i količinu spektrofotometrijom.