Sadržaj
DNA
Deoksiribonukleinska kiselina i proteini. DNA je organizirana u jedinice koje se nazivaju genima, a svaki od njih kodira za određenu RNA ili proteinski slijed. Geni se proučavaju kako bi se upoznala sa biološkom strukturom i funkcijama, evolucijom, bolestima i mnogim drugim aspektima živih sustava. Da bi se geni detaljno proučavali, DNK se mora izolirati i očistiti iz stanica koje vas zanimaju.
Ekstrakcija DNK
Iako se DNK iz jedne stanice može izdvojiti i proučavati, nije dovoljno da se vidi golim okom. Da biste dobili količinu dovoljnu za kalemljenje, više stanica morate raditi s boljima (mnogo milijuna).
Točni protokoli znatno se razlikuju kako bi se uzele u obzir jedinstvene karakteristike određenih uzoraka, ali glavni su koraci homogenizacija, liza, probava, odvajanje i prikupljanje. Postupak je najbolje provesti u maloj (ovisno o veličini uzorka) staklenoj ili plastičnoj cijevi.
Uzorak se općenito miješa ili miješa kako bi se stanice temeljito odvojile jedna od druge. To čini stanične sastojke dostupnijim reagensima koji slijede. Deterdžent ili enzimi se zatim dodaju homogenatu za liziranje staničnih membrana (i nuklearne membrane ako su stanice eukariotske) da bi se oslobodila DNA. U ovom trenutku, DNK je okružen proteinima, lipidima, ugljikohidratima - svime ostalim što se nalazilo u stanicama.
Daljnja enzimska probava može biti potrebna za razgradnju proteina kako se oni ne vežu na DNK i ometaju njegovo prikupljanje. DNK se odvaja od ostatka staničnog sadržaja dodavanjem hladnog, čistog, etilnog ili izopropilnog alkohola. DNK nije topljiv u tim alkoholima pa će se kondenzirati pokušavajući smanjiti njegov kontakt s alkoholom. Kondenzirana DNA tada se sakuplja, obično centrifugiranjem --- ili umotavanjem.
DNA spooling
Skupljanje DNK spaliranjem učinkovito je kada se dobije velika količina DNK iz postupka ekstrakcije. To je ujedno i izvrsna demonstracijska metoda s obzirom na to da je impresivna zamršenost čiste DNK jasno vidljiva.
Da bi se izolirao DNK, korak razdvajanja mora se provesti pažljivo. Ako nije bio dio prethodno dodane smjese reagensa za liziranje, otopini se mora dodati koncentrirana otopina soli (natrijev klorid) prije koraka dodavanja alkohola. Hladni alkohol polako se izlije sa strane epruvete, čime se formira sloj na vrhu vodene otopine, izbjegavajući miješanje. Ako se izvrši pravilno, alkohol će oblikovati vlastiti sloj na vrhu slanog sloja. Zatim dolazi umotavanje.
Za prikupljanje DNK iz slanog sloja pažljivo stavite staklenu posudu za miješanje iako sloj alkohola dok ne dotakne dno epruvete. Polako zavrtite šipku među prstima, dok promatrate sučelje između dva sloja. Ako ima dovoljno DNK, ona će se skupiti na sučelju između slojeva kako bi tvorila mliječno prozirnu masu. Zavrnite štap da biste omotali DNK oko sebe (to je dio za namatanje) i izvucite ga iz cijevi. DNK se može prenijeti u drugu epruvetu čistog alkohola radi čuvanja ili daljnje analize.