Sadržaj
Tekuća kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) laboratorijska je tehnika koja se koristi za odvajanje i identificiranje spojeva. To je vrsta kromatografije na stupcu koja se oslanja na različite polaritete spojeva u otopini kako bi ih razdvojili. HPLC se razlikuje od standardne kromatografije na stupcu jer upotrebljava pritisak da bržu silu otopine kroz kolonu i stoga daje brže, a ponekad i točnije rezultate. Cilj je odvojiti spojeve u stupcu i ostaviti ih odvojeno.
Coelution
Zbog brzine HPLC i oslanjanja na različite polaritete spojeva, dva spoja slične strukture i polariteta mogu izaći iz uređaja za kromatografiju u isto vrijeme ili gotovo u isto vrijeme. To je poznato kao uzdržavanje. Uzimanje uzoraka otežava precizno određivanje koji je dio smjese eluiran u tom trenutku.
Spojevi adsorbirani
HPLC obično koristi stakleni stupac napunjen kuglicama izrađenim od različitih materijala. Smjese koje se tjeraju kroz kolonu sadrže kemikalije koje se s različitom jačinom vežu na perle. Jačina vezivanja, koja ovisi o sličnosti u polaritetu, određuje koliko dugo će se kemikalija vezati na perlu prije nego što se oslobodi. Neki spojevi vežu se toliko snažno da se u biti nikada ne oslobađaju iz zrna u koloni i nikada se ne mjere u otopini koja izlazi iz stupca.
cijena
Tipične tehnike laboratorijskog odvajanja uključuju razvijanje testa ili metode razdvajanja, a zatim provođenje tog ispitivanja za odvajanje pojedinačnih spojeva iz otopine. Međutim, to obično rezultira s više rješenja koja također moraju proći procedure, što dovodi do eksponencijalnog povećanja složenosti. Iako HPLC često može pojednostaviti i ubrzati ovaj postupak, troškovi razvoja HPLC uređaja mogu postati ogromni. Razvijanje HPLC aparata, iako mnogo učinkovitije, mnogo je skuplje od razvoja drugih ispitivanja za odvajanje spojeva. Zbog toga to nije financijski održivo za mnoge male laboratorije u privatnom vlasništvu.
Složenost
HPLC se ne koristi samo za odvajanje jednostavnih spojeva, već se koristi i za izoliranje specifičnih proteina iz stanične smjese. U ovom slučaju kuglice u koloni obložene su antitijelom specifičnim za protein koji trebate sakupiti. Proteini vežu antitijela, a preostala otopina se propušta kroz kolonu, a zatim se proteini oslobađaju pomoću druge otopine i sakupljaju. To zahtijeva visoko kvalificiranog tehničara da nadgleda stupac u svakom trenutku i provjeri da li postupak teče točno onako kako je planirano.